• 核酸-蛋白质检测方法的进阶历程
    发布日期:2019-09-02 15:30   来源:未知   阅读:

  电泳迁移率转移法(EMSA)是一种检测核酸蛋白复合物特异性结合的有效方法。在过去的30年里,EMSA一直是研究核酸(DNA或RNA)与核酸结合蛋白之间定性相互作用的“检测手段”。通过使用放射性标记探针,可以比较信号在聚丙烯酰胺凝胶上的位置,从而确定定性的相互作用。此外,随着计算机和光学成像技术的新进展,EMSA已经从单纯的定性分析转变为定量分析。

  凝胶电泳是一种常用的根据分子量分离一组核酸或蛋白质的方法。通常,琼脂糖凝胶用于运行核酸,聚丙烯酰胺凝胶常用于蛋白质的分离。EMSA利用了凝胶电泳中,在电场均匀的情况下,大型核酸蛋白复合物的迁移速度要比单一蛋白慢得多(如下图)。为了解释这一点,我们来看看蛋白质的迁移。假设蛋白质x是一个基本单位(单体),它能够与其他蛋白质x结合形成一个更大的复合物,称为四聚体。在相同电场下,四聚体在凝胶电泳实验中总是比单体运行得慢得多。

  第1道:阴性对照(DNA),第2道:蛋白质+不结合的DNA,第3道:阳性对照。

  如果将同样的原理应用于DNA结合蛋白,如果存在特定的DNA -蛋白复合物,那么凝胶电泳后的带迁移将发生变化。DNA-蛋白复合物的带迁移通常用放射性标记的DNA探针来检测序列特异性相互作用,这些探测通常由正在检测的结合序列的线性延伸组成。可以选择在线 )-端标记放射性同位素,如磷酸盐-32 (32P)。电泳后,凝胶通过x射线胶片显示出来。为了更加确定特定的蛋白是否与DNA结合,研究人员还可以在复合物中添加针对核酸结合蛋白的单克隆抗体,导致“凝胶超移位”。

  研究蛋白质- DNA相互作用有多种方法,例如,如果你想描述DNA-蛋白复合物的特征,可以使用免疫沉淀(或DNA下拉),这涉及到使用带有磁珠标记的抗体。样品可以通过磁性柱纯化(下拉)。此外,一种更专业的染色质免疫沉淀分析(ChIP)有时可以代替EMSA。

  如上所述,传统的EMSA检测是使用放射性标记的核酸探针。虽然凝胶转移法的原理没有改变,新的检测试剂不断开发。现在,我们需要远离可能伤害我们自己和污染我们环境的放射性物质。可替代的,研究人员使用荧光染料或荧光素发光系统,这些新系统不仅在健康和环境方面更安全,而且比放射性装置更精确,往往产生更少的背景噪音。要使用荧光探针,需要一种具有激发光源的光学图像采集系统。通常,这些成像设备由两部分组成:1)控制图像聚焦和曝光的数码相机系统; 2)广谱光源(从紫外线到不同激发波长的激光器),以配合市场上不同种类的荧光染料。采用适当的技术,可以获得良好的成像效果。

  通常,这类试剂盒提供生物素标记的受控DNA和核提取控制设备,供您标准化您的实验。使用合适的检测设备,化学发光反应会发出清晰而强烈的信号。轻微的缺点是,需要对DNA模板(目标)进行生物素化,但通常也可以从商业来源定制DNA寡核苷酸。

  一些实验室已经成功地使用了EMSA的商用试剂盒,这些试剂盒被设计用来根据颜色分离核酸和蛋白质。核酸染成绿色,蛋白质染成红色。因此,当两者形成复合物时,最终颜色将是黄色。同样,可以在商业光学成像系统上可视化您的结果。这是一种非常简洁的快速检测方法,特别是当标记目标核酸不是最佳选择时。

  由Lewis KA领导的一个研究小组开发了一种使用琼脂糖凝胶的新方法,该方法比传统SDS-PAGE使用的聚丙烯酰胺更容易制备和表现。此外,该组能够通过在高电压下运行来减少运行时间并仍然获得高分辨率数据。但通常,增加电压可能导致拖尾效应。

  还有一些更专业的检测方法,例如,NF-kB检测试剂盒使用固定的靶序列DNA进行高通量筛选。它适用于96孔板形式,可以添加样品核提取物,使用能够检测核DNA复合物的单克隆抗体检测阳性结果。

  另一种潜在的高通量方法使用微流体芯片,设计用于分离不同大小的DNA片段。由Smith等人领导的研究小组报道,DNA-蛋白质复合物也可以使用这些微流体装置分离。EMSA在DNA-蛋白质相互作用方面具有广泛的应用,并且仍在添加和修改不同的检测方法。

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